乳佐粒径控制标准及解决方案

摘要：乳佐剂主要是由水相、油相、乳化剂和助乳化剂组成的液体。国内外对乳佐剂已有广泛研究，包括物料性质、稳定性、佐剂效果和安全性。乳佐剂的广阔应用前景促使科研工作者深入研究其增强免疫的机制，以期为新产品开发，标准质控及临床应用提供可靠的依据。目的：粒径大小是乳佐的重要性质和评价指标之一。方法：文中涉及的乳佐剂制备采用了高压微射流均质，采用动态光散射以及单颗粒光学传感技术研究了乳佐粒径分布状态。结论：通过纳米粒度仪以及全自动计数粒度分析仪可对乳佐的粒径进行多方位分析检测。

关键词：乳佐剂 纳米乳 微乳  粒径分布 均质机 动态光散射（DLS） 单颗粒光学传感技术（SPOS） 大乳粒

长期以来传染性疾病一直都是人类健康的重大威胁之一，目前接种疫苗仍然是控制它的有效手段。在众多行业黯然失色的年月里，疫苗行业这两年反而激增，疫苗佐剂发挥了不可替代的作用。上世纪末，人们研制出水-油乳剂（Oil-water emulsion）类型的佐剂，并大规模用于疫苗开发和临床试验。

粒径大小是微观颗粒的最重要性质和评价指标之一。依据纳米概念的定义，严格意义上将粒径10~100nm的乳剂称为纳米乳，粒径100~1000nm的称为微乳。颗粒的细胞运输方式具有显著的粒径依赖性，较小粒径的颗粒在作为疫苗佐剂时更具有潜在的优势。

乳佐剂一般需具有以下特征：

1. 均匀性好，运载并保护抗原，能有效包裹或吸附抗原。

2. 增加抗原表面积及大小，改变免疫应答的类型。

3. 缓释抗原，乳佐剂能延长抗原或多肽的半衰期，使抗原与淋巴系统有充分的接触时间，产生持久免疫应答。

4. 稳定性好：物理稳定性好且易过滤，经热压灭菌或离心不分层，易于制备和保存，适合大规模生产。

 有研究表明，佐剂颗粒的大小影响免疫反应的类型，200~600nm大小的颗粒容易通过淋巴结利用抗原递呈细胞激发Th1型细胞免疫反应，而2~8μm的颗粒则是由巨噬细胞的吞噬或胞饮作用运输至淋巴结，激发体液免疫。在研究SPO1微乳佐剂时发现150nm的颗粒佐剂效果较好，认为该种粒子既能有效吸附抗原又能激发吞噬细胞的识别，而100nm以下的颗粒不能捕获抗原，而200nm以上的则不稳定或不引发理想的免疫应答。有研究提出将500nm作为一个分水岭，因为500nm以上和小于500nm的粒子激发完全不同的免疫反应。乳佐剂虽然大小分布相对均匀，但其粒径仍是一个范围，以现阶段的研究资料，通过单一仪器来进行一个完全精确区分佐剂效果的界值相对还很难，我们以MF59为例，展示国际厂家在乳佐粒径控制上，通过DLS和SPOS技术进行的详细控制要求。^[3]

1）初剪切制备初始乳液，初乳平均粒径应控制在300nm~800nm，且大于1.2μm的油滴数量应控制在5*10⁹以下；

2）初乳经过微射流均质机处理以减少其液滴尺寸，微射流后的乳液平均粒径应控制在165nm以下，大于1.2μm的油滴数量应控制在2*10⁸/ml以下；

3）微射流处理后的乳液经过适当的亲水膜过滤。过滤可去除前置工艺流程中的大油滴，这部分油滴虽然数目很少，但这些油滴体积可能很大，它们或可成为聚集的成核位点，导致储藏过程中乳液降解。另外，过滤步骤可实现过滤除菌。过滤后的水包油乳液平均粒径一般在155nm±5nm，大于1.2μm的颗粒数量控制在5*10⁵ml/ml以下。

 为了获得稳定的乳佐剂体系，乳粒的制备及表征至关重要。乳液组分可用Nicomp 380测定平均乳滴粒径，可用Accusizer A7000 APS检测大于1.2μm以上颗粒数。

结论：通过详细控制要求我们可知 ，剪切后的初乳通过微射流均质机进行粒径控制，在粒径表征上，分别采用DLS进行粒径分布（平均粒径、PI值等）和SPOS技术进行尾端颗粒浓度控制（＞1.2μm的颗粒浓度）。

相关仪器如下：

微射流均质机

品牌：意大利PSI，PSI-20，PSI-40系列（实验室及中试型）；Infinity系列（生产型）

原理：高压微射流均质机通过电液传动的增压器使物料在高压作用下以极大的速度流经固定几何结构均质腔中的微管通道，物料流在此过程中受到超高剪切力、高碰撞力、空穴效应等物理作用，使得平均粒径降低、体系分散更加均一，由此获得理想的均质或乳化结果。

制备关键点：均质腔类型、均质腔孔径、均质压力

 应用：对于不同领域的各类均质需求，大致可以归纳为“乳化型”以及“解团聚型”，针对乳佐剂可选择“Y”型均质腔，物料流体在加速过程中被分为两股细流，通过细微空槽后正面碰撞混合，在获得较高的结合相对速度时其本身所受的碰撞力较柔和，此过程有利于混合、乳化作用。另外WO 2011/067669里也有介绍，Z型腔在尾端大颗粒的控制上，要比Y型腔有更好的效率。

                                                                             仪器外观

纳米粒度及Zeta电位分析仪

 品牌：美国PSS，Nicomp系列

 原理：纳米粒度仪采用动态光散射原理（DLS）检测分析样品的粒度分布。基于多普勒电泳光散射原理检测Zeta电位。其主要用于检测纳米级别及亚微米级别的体系，粒径检测范围0.3nm-10μm，Zeta电位检测范围为±500mV。DLS从传统的光散射理论中分离，关注光强随着时间的波动行为。我们通过光强值的波动得到自相关函数，从而获得衰减时间常量τ，跟进公式换算获得粒子的扩散系数，再根据Stocks-Einstein方程计算粒径大小。

 检测关键点：粘度、折光率、温度

 应用：用于分析乳佐剂整体粒径分布情况（包括平均粒径、PI值、D10、D90等），判断配方及工艺制备后粒径大小是否符合要求。

                                                                             原理图

                        仪器外观

全自动液体颗粒计数器

 品牌：美国PSS,Accusizer系列

 原理：单个粒子通过狭窄的光感区时阻挡了一部分入射光，引起到达检测器的入射光强度瞬间降低，强度信号的衰减幅度理论上与粒子横截面（假设横截面积小于光感区的宽度），即粒子直径的平方成比例。用标准粒子建立粒径与强度信号大小的校正曲线。仪器测得样品中颗粒通过光感区产生的信号，根据校正曲线计算出颗粒粒径。传统光阻法的范围下限一般到1.5μm。PSS开创性地通过光散射增加对小粒子的灵敏度，将单颗粒传感器的计数下限拓展至0.5μm。

 检测关键点：浓度、流速。

 应用：定量分析0.5μm以上的颗粒粒径分布以及浓度，弥补粒度分布仪器对尾端少量颗粒的不敏感性，从而判断均质工艺是否有效将尾端大颗粒进行控制。针对乳液这类高浓度样品，PSS粒度仪专为Accusizer A7000系列开发出的二部自动稀释系统，该系统可将超高浓度样品稀释至目标浓度，减少人工稀释的误差和时间成本。将样品自动稀释后，保证粒子“单个”通过传感器，开始采集数据。系统跟进稀释因子自动还原样品的原始颗粒浓度，解决了高浓度样品的检测难题。

                                                                                        仪器外观

  乳佐剂作为载药系统已引起广泛关注并有所应用，乳佐剂的均匀稳定性及合适颗粒大小能保护并缓释抗原，其增强免疫主要是基于纳米颗粒的性质和激发机体免疫应答，并因颗粒大小的不同引发不同型的免疫反应。从研发小试到工艺生产，通过表征数据来直观判断配方及工艺的有效性，对比不同配方及工艺对最终粒径大小、颗粒浓度，通过这些数据指标可适当调整配方以及微射流均质机压力和均质次数，进而优化制备工艺。

不同均质压力后体系尾端大颗粒浓度分布

红色：800bar   蓝色：1200bar

参考资料：

[1]赵兰华, 李映波. 乳佐剂免疫机制的研究进展[J]. 医学研究杂志, 2014, 43(2):4.

[2]Yu S,Tang C,S,Shi X,et al.Novel Th1 - biased adjuvant,SPO1,enhances mucosal and systemic immunogenicity of vaccines administered intranasally in mice(J).Vaccine,2012,30:5425 - 5436

[3]WO 2011/067669