SPOS技术：血细胞应用

简介：Accusizer780测试红细胞和白细胞的粒径分布和颗粒计数

传统上，红细胞和白细胞的计数分布都是通过电阻法测试的。粒子分散在导电介质中，当粒子通过一个小孔时会导致电阻的增加、电导率的下降，电阻的响应值与粒子大小和体积有关。虽然这项技术多年来应用良好，但本文可证明，使用SPOS（单粒子光学传感技术）结合自动稀释的颗粒计数器可更容易地确定红细胞和白细胞的粒径大小，与电阻法相比，可用的稀释剂种类更多，限制更小。

Accusizer780采用光阻法，单粒子光学传感技术(SPOS)的原理，可同时测试粒径分布和颗粒计数。传感器内部有一个激光，单个粒子在经过光感区域时，对激光造成遮挡，从而导致光强度下降，光强的减弱与粒子的横截面积成比例。Accusizer780配置有自动稀释模块，当样品浓度过高，导致多个粒子可能同时通过传感器感应区域(这个概率与颗粒浓度有关)，此时样品会被自动稀释。仪器可允许稀释后的样品在短时间间隔内同时计数大量粒子（500,000#/min），而避免粒子间的重合效应，这意味着粒子间不会相互遮挡，一次计数一个粒子，得到真实的粒度分布和统计精度。这其中仅需一条校准曲线即可将脉冲电压转换成相应的粒径，不需要复杂的数学算法。由于仪器具有自动稀释的能力，且一次计数一个粒子，因此可确定所有经过传感器的粒子都会被统计在内，且不会造成重复计数。这种测试方式决定了仪器在粒径分布上的高分辨率，尤其对于粒径主体分布小于1um的样品，可精准观测到尾端粒子的复杂分布情况。如前所述，Accusizer780颗粒计数器不仅能得到样品的粒径分布，还能做到精确的颗粒计数。

本文采用配有自动稀释功能的Accusizer780进行实验，用来测试一种新仪器的效率，该仪器可将血细胞的主要成分进行分离。在大多数医院，血细胞都是用电阻法进行颗粒计数分析。电阻颗粒计数器由两个电极，电解质盐溶液，一个带有小孔的非导电玻璃罩组成，电荷可从一个电极流向另一个电极。血液样品注入样品池的一端后，由于玻璃小孔一端的压力差不同，液体会流经小孔，从而导致电极间的电荷流动，相应的电流会发生变化，或维持电流不变，电压增加，电压或电流的响应值与样品池的排除体积成比例。通过这种方法，可确定血细胞的粒径分布和颗粒浓度。

电阻法有以下缺陷：① 电阻法要求样品悬浮在高导电率的分散剂中，这大大增加了操作成本；② 玻璃小孔很容易堵塞；③ 小孔的规格很小，会限制样品的流经速度，从而限制粒子的计数速率，以上这些因素都限制了电阻法测试血细胞的粒度分布和计数的使用。Accusizer780则没有以上问题存在，该技术基于光阻法的原理，任何合适的稀释剂都可使用。这一点对于血细胞分离装置很重要，因为它需要多种不同的缓冲液来实现不同程度的分离，而其他离子的存在会对分离产生不利影响。Accusizer780的样品流动池与红细胞和白细胞(凝块及其他大的凝聚物)的大小相比，流动池的尺寸很大，因此很少发生堵塞。最重要的是，仪器的稀释速度可高达120ml/min，对于来自分离器的高浓度血液成分，可做到快速的自动稀释以及精准的颗粒计数。

该实验测试的样品为血细胞，范围从红细胞居多的成分到白细胞居多的成分，总共分析了六个组分，命名从4到9。在“AN160”文献中，通过对样品4的zeta电位的检测可确定，样品4中几乎完全是红细胞，而5~9号样品则分别含有越来越多的白细胞。

图1显示了Accusizer780测试不同样品的粒径分布图：

除4号样品外，其他样品的粒径分布均由两个窄峰组成。第一个峰的粒径在8.5um左右，是红细胞的粒径大小，第二个峰粒径分布在11-12um左右，与白细胞的粒径大小匹配，所以可精准识别红细胞（第一个峰）和白细胞（第二个峰）的粒度分布及浓度占比。需注意的是，在图1中，第二个峰的浓度分布在样品4中几乎为0，但后续几个样品中数目越来越大。首先，这说明样品4实际上完全是红细胞，其次这一数据还表明，其他样品中的白细胞组分变得更加丰富。图2绘制了白细胞与红细胞的体积和计数的比率图。

图2a为峰2与峰1的体积占比，图2b为峰2与峰1的数目占比，这些数据可表明血液分离装置将红细胞和白细胞分离的程度大小。值得一提的是，样品4中的红细胞与白细胞的数目占比约为500:1（图中显示为0.002），但样品5-9中，占比在逐渐增加（样品9的比率接近0.3，约是正常值的100倍），这进一步说明了分离装置的效率。这一数据还表明，Accusizer780可以用于定量测量样品中红血球和白细胞的相对数量。

若使用电阻法测试白细胞数量，则在测试前须先溶解（破坏）红细胞，因为红细胞的绝对数量往往会使白细胞的计数变得更困难及不准确。众所周知，溶解会对红细胞和白细胞造成影响，使得红细胞几乎完全被破坏，而白细胞的细胞膜则被剥去并团聚在一起，形成不同的颗粒。图3测试了样品6在溶解后的粒度分布，在6-7um处出现一个单峰，且颗粒数目大大减少。根据我们已知的化学溶解效应，图3中的分布粒径是白细胞溶解后的残留，而实际存在的第二个窄峰在溶解后就消失了。

综上所述，本文提供的数据表明，SPOS可以同时测试红血球和白细胞的粒径分布和颗粒浓度。此外，还可配置自动稀释模块对样品进行自动稀释，用这种方法可在不溶解红细胞的前提下，对红细胞和白细胞进行定量分析。研究表明，溶解会完全破坏红细胞，但只会将白细胞的粒径大小从12um降低到6.5um左右。