本文摘要

蛋白质药物（生物药）的研发中，最让研究人员头疼的，往往不是“造出分子”，而是“让它稳定”。同一款蛋白，换一个缓冲液配方，稳定性就可能天差地别！这直接关系到生物药产品的保质期、安全性和开发成本。

怎么在最短时间内找到最能稳定蛋白的缓冲体系？我们用马尔文帕纳科Zetasizer Core高通量蛋白稳定性分析仪的一个溶菌酶案例讲清楚。

判断蛋白“稳不稳”，看三个信号

在生物制药的开发、制剂优化和质量控制全过程中，蛋白质稳定性都是一项关键的考量因素。要把“蛋白稳定性”说清楚，先认识三种常用检测技术，它们各有分工：

·DLS（动态光散射）：给蛋白“量身材”。看蛋白是以单体存在，还是已经聚集，粒径是否均一，可以提前提示制剂质量发生变化。

·DSF（差示扫描荧光）：给蛋白“测体温”。给样品逐渐升温，看它在多少度发生变性，这个熔解温度（T_m）越高，通常说明蛋白越稳定。

·SLS（静态光散射）：盯住蛋白“何时聚集”。在升温过程中捕捉聚集的起始点（通常定义为T_agg）。

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过去往往要分几台仪器、分几次实验才能拼齐这三种测试的检测数据。而马尔文帕纳科最新发布的 Zetasizer Core 蛋白稳定性分析仪，把 DLS、SLS 和内源荧光 DSF 整合到同一平台——同一样品、同一测试条件下一次测量，尺寸、聚集与热稳定性出自同一体系，比对更可靠。

为什么缓冲液这么关键？

缓冲液的 pH、离子强度和成分，会直接影响蛋白的带电状态与折叠构象，进而影响它的热稳定性和长期稳定性。选对缓冲液，本质就是在制剂开发早期锁住最有利的条件，帮研发人员缩短开发周期、减少后期返工。

真实案例：溶菌酶 × 五种配方

01 实验材料及检测方法

实验把 1 mg/mL 的溶菌酶配成 5 种体系：PBS、醋酸盐缓冲液（pH 4.0）、50 mM HEPES（pH 7.0）、10 mM Tris（pH 7.0）、10 mM NaCl。使用Zetasizer Core蛋白稳定分析仪中的多模块进行测试：先用 DLS 量粒径，再用 DSF + SLS 测热稳定性和胶体稳定性，每个配方做 8 个重复孔验证重复性。

将20μL样品分装至384孔圆底Aurora微孔板的单个孔中。DLS测量在背向角（158°）下进行，每孔三次采集，每次采集时间1秒。热稳定性测量采用 25 °C 至 85 °C 的温度范围，升温速率为 1 °C/min，对应连续测量 1 °C 的温度增量。内源荧光测量使用 280 nm 激发波长，UV 强度 100%。同时，以一定激光强度在 830 nm 处测量静态光散射（SLS）。

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这样成体系的对比筛选，正是 Zetasizer Core 的强项：它支持最高约每分钟 192 个样品的高通量测量，最低上样量仅 4 µL，且只使用标准微孔板、无需专用耗材，几步即可完成设置出结果。换句话说，用同样多的蛋白样品，研发人员能在更短时间内跑完更多缓冲液组合，尽早锁定候选方案——这正是生物药早期筛选看重的“快”与“省”。

02 测试结果

先看 DLS：大部分都“身单影只”

所有体系的平均流体动力学直径都在 3.5 nm 左右、多分散指数较低，说明溶菌酶在受热前基本以单体、单体状态存在。唯一例外是 HEPES——粒径最小（3.16 nm），但多分散指数最高（0.19），分布明显更宽，这通常是稳定性欠佳的早期信号。

图1 溶菌酶在不同缓冲液中的粒径分布：HEPES 分布最宽，稳定性信号初现（数据来源：马尔文帕纳科应用报告）

再看 DSF/SLS：醋酸盐最能“扛热”

热去折叠结果显示，醋酸盐缓冲液表现最好：熔解温度 Tm1 高达 77.2 °C，起始去折叠温度 72.8 °C，比 PBS 高了约 5 °C，热稳定作用显著（与溶菌酶在温和酸性下的天然稳定特性相符）。NaCl 和 Tris 也比 PBS 略有提升；HEPES 的热稳定性最低，和 DLS 看到的更宽粒径分布相互印证。

而 SLS 的聚集信号，只在 PBS 中清晰出现，多数体系并没有明确的聚集转变——这说明去折叠与聚集并不总是同步发生。正因如此，判断蛋白稳定性不能只靠单一技术，多角度、正交验证才更可靠。

图2 不同缓冲液中溶菌酶的热去折叠曲线：a) DSF，b) SLS；在醋酸盐缓冲液中表现出最高的热稳定性（数据来源：马尔文帕纳科应用报告）

给研发人员的判断框架

通过上述测试结果，把三种技术的检测数据叠在一起，本次溶菌酶缓冲液筛选的结论就很清楚了：

·醋酸盐缓冲液（pH 4）：测试范围内最优，兼具热稳定性与窄粒径分布；

·对溶菌酶而言，HEPES 缓冲液最不利，热稳定性低、粒径分布宽；

·方法学提示：早期制剂开发用“高通量 + 多技术组合”筛选，能更快锁定候选配方。

结语

看懂方法，比记住结论更重要！需要说明的是，这只是一例模型蛋白的结论，不同蛋白的“最佳缓冲液”并不相同；但马尔文帕纳科Zetasizer Core高通量蛋白稳定性分析仪“DLS+DSF/SLS组合，重视重复性验证”的方法，可以在不同蛋白质的缓冲液筛选中迁移复用。

>>> 关于马尔文帕纳科

马尔文帕纳科（Malvern Panalytical）是全球材料表征领域的专家。随着Micromeritics ——技术高度互补的新成员加入，进一步完善了马尔文帕纳科的材料表征解决方案。

马尔文帕纳科的使命是通过对材料进行化学、物性和结构分析，打造出更胜一筹的客户导向型创新解决方案和服务，从而提高效率和产生可观的经济效益。通过利用包括人工智能和预测分析在内的最新技术发展，我们能够逐步实现这一目标。这将让各个行业和组织的科学家和工程师可解决一系列难题，如更大程度地提高生产率、开发更高质量的产品，并缩短产品上市时间。