利用BUCHI SFC系统
加速尿嘧啶和黄嘌呤类化合物的制备分离
尿嘧啶和黄嘌呤类物质，即咖啡因、可可碱和茶碱，是一类在各种人类生物活动过程中发挥重要作用的有机化合物。这些分子属于杂环化合物类，其特点是含有既有碳又有氮原子的环结构。尿嘧啶是 RNA 的基本组成部分，是构成遗传密码并参与蛋白质合成的核碱基之一。
另一方面，咖啡因、可可碱和茶碱这些黄嘌呤类物质，是结构相似但具有不同生物效应的生物碱。这些黄嘌呤类物质存在于各种植物来源中，是众所周知的刺激物质，能够穿过血脑屏障并影响中枢神经系统，目前成熟且广泛应用的分离方法往往是利用 RP-HPLC（反向色谱法）。
▲ 图示：利用 YWG C18（150 x 4.6mm，5μm）色谱柱，7.5% 甲醇等度，10mmol/L KH2PO4-Na2HPO4 缓冲液（pH 5.0）分离混合物，紫外检测波长 260nm。1.尿嘧啶；2.胸腺嘧啶；3.腺嘌呤；4.可可碱；5.尿嘧啶丙酸；6.茶碱；7.咖啡因[1]
关于此类应用的反向色谱法已经被优化到了极致，因此在本文中，我们想尝试以不同的方式来分离这些化合物，找出一个更快、更高效的解决方案。
SFC（超临界流体色谱）是一种色谱技术，其移动相的一个重要组成部分是超临界二氧化碳。二氧化碳处于超临界状态时具有独特的性质，如高扩散系数和低粘度，使其成为化合物分离和分析的优良溶剂。SFC 相对于传统色谱方法具有许多优势，包括更快的分析时间、更低的溶剂消耗以及在分离中的差异选择性。此外，与 RP-HPLC 相比，SFC 代表了一种正交技术，为各种分析挑战提供了互补的分离能力。
在 SFC 中，筛选色谱柱并找到最适合特定分离任务的固定相，是提高分离度的关键步骤。固定相是色谱系统的重要组成部分，因为它直接影响选择性。不同的固定相具有不同的化学功能和与样品相互作用的能力，使其对特定化合物更具选择性。通过筛选和选择合适的色谱柱，可以优化分离条件，实现目标分析物的更好分辨率和灵敏度。
本文描述了使用 Sepmatix 8x SFC 平行色谱分析系统对尿嘧啶、咖啡因、可可碱和茶碱混合物进行平行柱筛选，并随后将方法放大到制备型 Sepiatec SFC-50 仪器的过程。
设备
▲ Sepmatix 8x SFC 超高效平行色谱系统
▲ Sepiatec SFC-50 制备色谱系统
色谱柱
BUCHI PrepPure 硅胶, 5 um, 250 x 10 mm制备色谱柱
BUCHI PrepPure 二醇基, 5 um, 250 x 10 mm制备色谱柱
BUCHI PrepPure PEI, 5 um, 250 x 4.6 mm
BUCHI PrepPure CBD, 5 um, 250 x 4.6 mm
BUCHI PrepPure 硅胶, 5 um, 250 x 4.6 mm
BUCHI PrepPure 二醇基, 5 um, 250 x 4.6 mm
BUCHI PrepPure 氨基, 5 um, 250 x 4.6 mm
BUCHI PrepPure 2-EP, 5 um, 250 x 4.6 mm
Reprosil 4-EP, 5 um, 250 x 4.6 mm (Dr. Maisch GmbH)
氰基, 5 um, 250 x 4.6 mm, (Dr. Maisch GmbH)
1 试剂与样品
食品级二氧化碳（99.9％）
甲醇（≥ 99％）
尿嘧啶（99+％）
可可碱（99％）
咖啡因（99+％）
茶碱（99％）
样品准备：在 50/2.5mL 甲醇/水中，溶入50mg 尿嘧啶，70mg 咖啡因，55mg 可可碱和85mg 茶碱，需加热至 40℃，并配合超声波辅助溶解。
2 实验部分
1、利用 Sepmatix 8x SFC 筛选色谱柱
筛选结果：
使用 Sepmatix 8x SFC 平行色谱仪器可以高效地同时筛选 8 根柱。因此，可以在很短的时间内确定最佳选择性。为此，使用了8种不同的固定相：硅胶、氨基、氰基、二醇基、2-EP、4-EP、PEI 和 CBD（型号请见上文），具体表现请看下图。
▲ 图示：8根不同固定相的色谱柱在分离尿嘧啶，咖啡因，可可碱和茶碱混合物时的表现。
结果显示除了氰基、2-EP 和 4-EP 相外，所有其他固定相都可以分离样品，因此我们需要分析最佳分离度的固定相。此时，分辨率（R）可以量化分析物之间的分离程度。
在处理复杂混合物时，R 值尤为重要，因为它确保每种分析物都能被很好地分离并准确识别和定量。R 为 1 表示峰根本没有分离，实质上是合并的，而更高的R值表示峰之间的分离更好。在实践中，R 至少为 1.5 通常被认为是适合进行正确定量和鉴定分析物的。
tR2 和 tR1 =组分 1 或组分 2 的保留时间
W1 和W2 =组分 1 或组分 2 的峰高的一半处的宽度
我们将不同固定相的R值计算并列入下表进行对比：
筛选和 R 值的评估显示，硅胶、二醇基和 PEI 相具有最佳的选择性来分离样品，我们需要结合分离图谱来筛选合适的固定相。在硅胶柱上，第一个与第二个峰并未呈现完全的基线分离。使用 PEI 相时，由于样品分子的较高滞留性，运行时间相对较长。而二醇基无论在分离度和时间上都有出色的表现，因此我们最终选择二醇基作为制备分离时的固定相，色谱柱为 BUCHI PrepPure 二醇基, 5 um, 250 x 10 mm 制备色谱柱。
2、使用 Sepiatec SFC-50 制备分离样品
在 SFC 上，我们可以通过堆叠进样的形式来制备纯化，其生产率明显高于通过多次进样进行的梯度纯化。由于堆叠进样只能在等度条件下进行，因此需要先摸索不同等度比例下样品分离效果。
实验结果：
▲ 图示：33% 等度甲醇，4min 条件下，尿嘧啶，咖啡因，可可碱和茶碱混合物的分离效果
▲ 图示：12% 等度甲醇，5min 条件下，尿嘧啶，咖啡因，可可碱和茶碱混合物的分离效果
由上图可得知，33% 的甲醇条件下，尿嘧啶，咖啡因，可可碱和茶碱无法被完全分离，而 12% 的甲醇条件下，样品分离度非常好。以此为基础，我们进一步去开发叠层进样的方法。
通过 Sepiatec SFC 的智能叠层进样时间推荐，我们把叠层进样的时间设置为 2.42 分钟，既每 2.42 分钟一次注入一次样品，总计 8 次，上样量增加到 0.12mL。
▲ 图示：通过 2.42min 间隔的叠层进样在短时间内进行8次制备分离
▲ 图示：多次进样的叠加图片
每次进样的相应叠加 UV 信号表明该方法具有良好的重现性，垂直线描述了收集相应份数的时间窗口。
硅胶色谱柱的分离：
为了与二醇基填料进行对比，我们也尝试使用硅胶填料进行叠层进样与分离，其参数如下：
实验结果：
▲ 图示：通过 2.15 min 间隔的叠层进样在短时间内进行 7 次制备分离
▲ 图示：多次进样的叠加图片
与二醇基相比，硅胶在 100bar 下表现更好，时间也更短。但是，在 R=1.57 的分辨率下，第一与第二个峰并不能理想地基线分离，会造成部分样品损失。
2 结论
在这个应用中，使用 Sepmatix 8x SFC 平行色谱仪器进行了柱筛选，并将最佳色谱柱放大到 Sepiatec SFC-50 仪器。在色谱参数分辨率和运行时间方面，二醇基显示出最佳结果。作为对比，还开发了一种用于硅胶柱的方法，但分辨率值略低。这表明，如果需要用 SFC 制备并获取大量化合物，通过柱筛选事先确定最佳色谱条件是很重要的。之后，该方法可以简单地放大至制备级 SFC 上，并最终进行优化，配合叠层进样，获取大量样品。3 参考
1.韩金土, 乐良. 生物碱基及其衍生物的反相离子对色谱行为研究. 信阳师范学院学报（自然科学版）第12卷，第2期，1999年4月
