摘要

目前还没有获得美国食品和药物管理局许可的预防埃博拉病毒(EBOV)感染的疫苗。 目前正在开发的埃博拉病毒候选疫苗，以及目前大多数获得许可的疫苗，都需要在连续冷链下运输和储存，以防止产品效力下降。 冷链需求在发展中国家特别难以满足。 为了提高热稳定性和降低昂贵的冷链需求，使用冻干技术将一种对抗埃博拉病毒的亚单位蛋白疫苗配制成玻璃状固体。 将添加微颗粒氢氧化铝的关键抗原——埃博拉糖蛋白(EBOV-GP)配制成液体和冻干形式，并将疫苗在40°C条件下孵育12周。 在12周的潜伏期期间，在液体制剂中观察到EBOV-GP的聚集和降解，而在冻干制剂中变化很小。 在BALB/c小鼠肌肉内三次免疫后，对EBOV-GP的抗体反应测定疫苗的免疫原性。 EBOV-GP制剂在液体和冻干形式中具有同等的免疫原性。 经过冻干和重组，添加佐剂的疫苗制剂在小鼠体内产生的抗ebov - gp IgG抗体反应与相应的添加佐剂的液体疫苗制剂产生的抗体反应相似。 更重要的是，注射40°C孵育12周的重组冻干疫苗制剂小鼠的抗体反应表明，高温储存后疫苗的免疫原性完全保留，为未来疫苗开发工作提供了希望。  

背景介绍

埃博拉病毒病(EVD)是一种致命的病毒性疾病，最早于1976年在刚果民主共和国被报道。 过去50年来，埃博拉病毒病在多个非洲国家零星爆发。 最大规模的疫情是2014年至2016年在塞拉利昂、几内亚和利比里亚爆发的疫情，期间共确诊28616例埃博拉病毒病，导致11310人死亡。 目前还没有获得许可的埃博拉病毒疫苗。 因此，埃博拉病毒疫苗是全世界研究工作的主题。 一些候选疫苗在动物模型中显示出了希望，一些主要通过病毒载体传播的EBOV候选疫苗的人体临床试验结果已被报道。 从疫苗的制造到运输和储存，必须控制疫苗所暴露的温度，通常都是在很窄的范围内，以保持其效力。 例如，由默克公司开发的EBOV主要候选疫苗VSV-ZEBOV，在塞拉利昂、几内亚和利比里亚进行了测试，目前用于刚果民主共和国正在爆发的疫情，需要在- 60至- 80°C之间持续储存。 据报道，Janssen疫苗公司正在开发的埃博拉疫苗Ad26-ZEBOV在40°C的注射器中可稳定保存6小时，但在25°C的注射器中保存3个月后，药品的效价受到“显著影响”。 在低收入和中等收入国家，包括有埃博拉疫情历史的国家，维持这些“冷链”需求成本高昂，尤其困难。 此外，由于冷链的要求，为未来疫情准备的潜在库存所需的物流配置变得更加复杂。 因此，我们需要一种抗埃博拉病毒疾病的耐热疫苗，这种疫苗可以消除对连续冷链的需求。  

冻干法常用于稳定治疗用蛋白制剂。 在这个过程中，首先将含有蛋白质和玻璃化辅料(如海藻糖或蔗糖)的液体溶液冷冻，在冷冻浓缩辅料的玻璃状基质中形成细小的冰晶悬浮液。 然后，在真空下通过升华去除冰，理想情况下留下一个固体的玻璃状基质，治疗性蛋白被嵌入其中。 这种玻璃状固体基质中的分子运动受到高度限制，这抑制了需要大量分子运动的降解途径，如蛋白质聚集。 配方的冻干蛋白配方可以在较长时间内保持稳定(例如，至少18-24个月)，甚至在室温下也可以。 

为了使其具有足够的免疫原性，基于亚单位蛋白抗原的疫苗通常需要添加佐剂，如微颗粒氢氧化铝悬浮液。 这是一个挑战，因为这些疫苗的配方必须保证足够的稳定性，不仅对蛋白质抗原，而且对任何添加的佐剂。 佐剂蛋白亚单位疫苗制剂的常规冻干是有问题的，因为最初的冷冻步骤可能会破坏佐剂悬浮液的稳定性。 用微粒佐剂作为佐剂的疫苗配方的冷冻尤其成问题，因为微粒悬浮液的冷冻会引起团聚并导致疫苗效力的丧失。 在冷冻过程中，纯冰晶体形成，浓缩佐剂、抗原和任何添加的溶质(如盐和缓冲液)的剩余悬浮液，有时倍数为15-20倍或更多。 高浓度悬浮的佐剂颗粒、高离子强度和潜在的冷冻引起的pH值变化的结合会使佐剂悬浮不稳定，导致不可接受的颗粒团聚。  

我们已经表明,freezing-induced扰动的氢氧化铝悬浮液可以最小化通过配方和冻干工艺条件,降低的程度freezing-induced浓度以及制定的时间花在冷冻浓缩液体状态。 首先，我们将含有相对高浓度(如9.5 wt%)玻璃形成剂海藻糖的溶液冻干。 在冻结过程中，海藻糖最大浓缩到约76 wt%，因此9.5%的起始浓度限制了所有溶质可能的冻结浓度增加约8倍。 其次，我们用醋酸铵作为缓冲液。 由于乙酸铵具有挥发性，在冻干过程中会蒸发，进一步降低了冷冻浓缩对离子强度的影响。 最后，通过使用预冷式冷冻干燥机货架和快速冷冻干燥机货架冷却速度，我们限制了初始冻结和液体达到玻璃化转变温度之间的时间，从而最大限度地减少了由冷冻浓度引起的氢氧化铝颗粒团聚。  

在本研究中，我们应用了这些冻干配方和加工策略，以减少在一种使用昆虫细胞表达的EBOVGP作为抗原的耐高温、氢氧化铝佐剂亚单位蛋白疫苗中冻干引起的氢氧化铝团聚现象。 仅含该抗原的疫苗配方对感染埃博拉病毒的小鼠模型具有保护作用; 这些保护性反应在含有佐剂的配方中增加。 为了测试配方的热稳定性，将疫苗在40°C孵育12周，并采用各种生物物理技术进行表征。 用各种EBOV-GP疫苗配方肌内免疫BALB/c小鼠后产生的抗体反应来量化所测试疫苗配方的相对免疫原性。  

材料

疫苗抗原EBOV-GP是在夏威夷大学生产的，如前所述。 氢氧化铝佐剂(Alhydrogel®2%)来自Brenntag Biosector (Frederikssund，丹麦)。 考马西®亮蓝G-250购自MP Biomedicals LLC (Solon, Ohio)。 使用Bio-Rad实验室(Hercules, CA)的PROTEAN®TGX™凝胶。 Anti-EBOV GP小鼠/人嵌合单克隆抗体(c13C6 FR1)购自IBT Bioservices (Gaithersburg, MD)，碱性磷酸酶Affini-纯山羊抗人IgG, Fcγ片段特异性购自Jackson免疫研究实验室(West Grove, PA)。 乙酸铵、三羟甲基氨基甲烷、甘氨酸和磷酸钠购自Sigma Aldrich(圣路易斯，MO)。 海藻糖来自Pfanstiehl, Inc. (Waukegan, IL)。 材料来自Thermo Fisher Scientific (Walthan, MA)，包括硫酸钠，丙烯酰胺，硝基蓝四唑(NBT)， 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐(BCIP)，注射用HyClone™水，10×磷酸盐缓冲盐溶液(10XPBS)，含1.37M氯化钠，0.027M氯化钾和0.19 m磷酸盐。 FIOLAX®玻璃瓶(3ml)取自Schott(黎巴嫩，PA)。 丁基橡胶冻干塞(13毫米)购自Kimble Chase Life Science and Research Products, LLC (Vineland, NJ)，铝密封件购自West Pharmaceutical Services, Inc. (Exton, PA)。 用于动物注射，非硅化HSW规范- ject®无菌1- mL注射器(Henke Sass Wolf, Tuttlingen，德国)和BD™25G 5/ 8英寸。 使用无菌针头(Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA)。 黄花™动物柳叶刀(Medipoint Inc.， Mineola, NY)用于下颌下出血，血液收集在高压釜1.7 mL聚丙烯管。

液体疫苗配方

疫苗配方由0.1 mg/mL EBOV-GP、10mM乙酸铵和9.5% (w/v)海藻糖组成，pH为7。 EBOV-GP在10mM乙酸铵中储存在- 80°C，储存浓度为1.3 mg/mL。 使用前，将EBOV-GP原液在室温下解冻，以10000 g离心5分钟，以去除冻结和解冻原液中可能存在的任何不溶性蛋白聚集物或其他颗粒。 将离心后的EBOV-GP原液上清液用含12% (w/v)海藻糖的10mM乙酸铵和足够量的10mM乙酸铵稀释，得到0.1 mg/mL EBOV-GP液体疫苗制剂的终浓度为10mM乙酸铵和9.5% (w/v)海藻糖。 一些疫苗配方中添加了微颗粒氢氧化铝，Alhydrogel®。 在这些配方,2%的悬浮液Alhydrogel®(10毫克/毫升)抗原原液含有1.3毫克/毫升EBOV-GP在10毫米醋酸铵,12%海藻糖在10毫米醋酸铵的溶液,和足够的10毫米醋酸铵被添加到1.6毫升聚丙烯离心管产量最终配方含0.1毫克/毫升EBOV-GP, 在9.5mM乙酸铵中添加0.5 mg/mL铝和9.5%海藻糖。 在4°C的条件下，将这些配方端到端旋转1小时，以使EBOV-GP吸附在氢氧化铝颗粒上。 溶液用无菌水配制，用于制备缓冲液和蛋白制剂的容器用高压灭菌器或购买的无菌设备灭菌。 2%的Alhydrogel®是无菌购买的，使用无菌技术从瓶子中取出等分。 对于未冻干的疫苗制剂，将1ml液体疫苗制剂配制成3ml玻璃瓶，加塞，并用铝盖密封。 在给药之前，这些液体疫苗制剂在4°C保存，或在40°C孵育12周。  

疫苗配方的冻干和重组

FTS系统LyoStar冻干机(Warminster, PA)用于疫苗制剂的冷冻干燥。 EBOV-GP制剂使用的配方赋形剂和冻干循环与Hassett等人使用的基本相同。将冻干机格架预冷至−10°C。 3毫升FIOLAX®玻璃小瓶(Schott，黎巴嫩，PA)装满了1毫升各种液体疫苗配方，小瓶的中间放置了小瓶塞子。 然后将小瓶放置在冻干机样品室的预冷架子上。 为了尽量减少由于辐射和边缘瓶效应而对单个瓶的热传递的变化，装有试验疫苗配方的样品瓶被装满水[34]的瓶子包围。 在冻干循环的冷冻阶段，冻干机的货架温度以0.5°C/min的速度下降到- 40°C，然后在- 40°C保持1小时，以确保瓶内内容物完全冷冻。 将冻干机压力降至8 Pa开始一次干燥，架子温度以1°C/min的速度升高至−20°C，并保持20 h。 压力持续控制在8 Pa同时二次干燥开始通过增加冻干机搁板温度0°C的速度0.2°C /分钟,其次是增加到30°C 0.5°C /分钟,温度5 h举行。在周期的结束, 在冻干机中回充过滤后的氮气，直至达到常压状态，在充满氮气的冻干室中，通过手动折叠冻干机架子将瓶塞从半程位置移动到完全插入、密封的位置，自动密封小瓶。 密封的小瓶从冻干机中取出后，小瓶瓶塞用铝盖固定。 部分冻干疫苗在40°C保存12周; 未经过高温储存的冻干疫苗制剂在使用前保持在- 80°C。 在给小鼠使用之前，将冻干疫苗配方与所需的注射用水(WFI)进行重组，以获得1.0 mL的总体积。重组疫苗配方轻轻混合，并在试验前在实验台上放置至少30分钟。 另一种疫苗配方包括一种重组的冻干疫苗配方，其中在冻干和重组后加入氢氧化铝微粒。 该制剂在冻干制剂中加入注射用水，然后加入氢氧化铝悬浮液，最终浓度为0.5 mg/mL氢氧化铝，总体积为1.0 mL。 采用与含氢氧化铝的液体配方相同的方法，将配方从小瓶转移到1.6 mL的聚丙烯离心管中，并在4°C下端对端旋转1小时，以使EBOVGP吸附在氢氧化铝颗粒上，然后进行测试。  

使用流式颗粒成像技术FlowCam®( Fluid Imaging Technologies, Scarborough, ME)获得微米级范围内的颗粒浓度和数字加权粒度分布。 在分析前对冻干配方进行重组，并在3个重复中进行测量。 

在含有氢氧化铝的配方的色谱图中没有检测到可溶性蛋白，这表明基本上所有的EBOVGP都被吸附到颗粒上(数据未显示)。 使用FlowCam®监测配方中的不溶性蛋白质和氢氧化铝颗粒。 液体EBOV-GP、冻干EBOV-GP和重组EBOV-GP中氢氧化铝颗粒的平均直径分别为2.7±0.1 μm和4.7±0.1 μm。 这表明在冻干和/或重建过程中发生了一些氢氧化铝的团聚。 然而，冻干和重组后的平均直径远低于报道的佐剂活性的上限10 μm。  

注射液体形式的EBOV-GP疫苗制剂的小鼠和注射重组冻干形式的EBOV-GP疫苗制剂的小鼠产生了类似的针对EBOV-GP的IgG抗体反应，表明液体和冻干配方具有相同的免疫原性。 此外，在重组和注射前在40°C孵育12周的冻干疫苗配方小鼠的抗体应答与未孵育的冻干疫苗配方小鼠的应答相似。 因此，冻干EBOV-GP疫苗配方在接近埃博拉暴发地区最高环境温度的温度下储存12周后，免疫原性并不下降。  

在40°C条件下孵育12周后，液体制剂中EBOV-GP的聚集状态发生改变，而冻干制剂中只出现很小的变化。 因此，我们预计液体制剂在40°C孵育后免疫原性会相应下降。 然而，在40°C下培养含铝羟基佐剂的液体EBOV-GP配方12周并没有降低对EBOV-GP的抗体反应。 用构象敏感的c13C6抗体和SE-HPLC进行Western blotting显示，该制剂中EBOV-GP的组装状态发生了变化，但抗体反应对这种物理降解不敏感。 构象敏感的c13C6抗体也与降解产物结合，因此被认为是具有适当免疫原性的关键抗原表位似乎在降解的蛋白组分中保留了下来。 这与荧光猝灭结果一致，表明EBOV-GP保留了近天然的三级结构。 注射了含氢氧化铝的冻干疫苗的小鼠在第35天第2次剂量后和第56天第3次剂量后抗ebov - gp IgG MFI值相似。 对这些结果的一种解释可能是，在研究中使用的10 μg剂量时，免疫反应达到饱和，因此只需要最初存在的一小部分EBOV-GP就可以产生显著的抗体反应。  

正如预期的那样，含有常见疫苗佐剂氢氧化铝的EBOV-GP疫苗配方比不含佐剂的EBOV-GP疫苗配方更具有免疫原性。 冷冻通常会导致氢氧化铝颗粒聚集，在疫苗配方中产生直径可达10-100 μm的颗粒。 这些冷冻诱导的佐剂颗粒尺寸增加的影响仍然存在争议。 冷冻可导致疫苗失效。 一项研究表明，铝盐佐剂颗粒在冷冻和干燥过程中的团聚是导致这种冷冻引起的免疫原性损失的原因，但在随后的研究中，检查了铝盐佐剂疫苗的冻融稳定性， 免疫反应并没有因为冷冻引起佐剂粒径分布的变化而改变。 无论冷冻诱导的佐剂团聚是否会改变免疫原性，疫苗配方中存在大团聚不大可能在药学上是可接受的。  

在本研究中，冻干后的颗粒平均直径小于5 μm，可能是因为配方中9.5%海藻糖的存在抑制了团聚。 这些结果与Clausi等人的研究结果一致，他们发现高浓度的无定形成型辅料可以减少氢氧化铝在冻干过程中的聚集。 此外，我们的研究发现，在稀释液中冻干后加入氢氧化铝的重组冻干疫苗配方注射小鼠的抗体反应与在冻干前加入氢氧化铝的配方注射小鼠的抗体反应相同。 这表明，尽管添加了氢氧化铝的EBOV疫苗配方在冻干循环过程中受到了冷冻，但冷冻引起的氢氧化铝悬浮液的变化很小，不会影响疫苗的免疫原性。  

开发稳定的冻干埃博拉疫苗配方可以大大减少冷链需求。 尽管我们测试的液体配方和冻干配方的免疫反应是相同的，但在40°C条件下培养后在液体配方中观察到的EBOV-GP蛋白的物理降解可能会限制液体配方在缺乏严格冷链要求的情况下的可接受性， 促进冻干制剂的使用。 然而，应该指出的是，冻干配方带来了额外的挑战，如需要现场重组和需要单独的稀释剂瓶，这需要额外的存储空间，或双筒注射器内的冻干，这增加了成本。  

总结

液体EBOVGP制剂在高温孵育后，蛋白质组装状态显著降解，而冻干制剂的蛋白质组装状态变化最小。 我们的研究结果表明，与液体EBOV-GP配方相比，冻干不会降低疫苗在小鼠中的免疫原性。 此外，注射重组冻干疫苗配方(注射前在高温下孵育12周)的小鼠的抗体反应与注射未在高温下孵育的重组冻干疫苗配方的小鼠的抗体反应相似。 说明高温贮存后疫苗免疫原性无损失。 冻干EBOV-GP疫苗配方具有耐热性，并有可能在分发和储存期间消除对冷链的需要。 有希望的结果导致继续研究EBOV GP和其他丝状病毒候选疫苗的热稳定性。