腺相关病毒（AAV）是基因治疗中强大的递送载体[1]。然而，在AAV组装过程中，其包装核酸序列的效率较低，导致只有一小部分病毒颗粒携带目标基因[2,3]。富集纯化这些正确组装的病毒颗粒是下游纯化工作流程中的关键步骤，而金标准氯化铯（CsCl）密度梯度超速离心（DGUC）是最佳方法之一[4]。尽管使用CsCl-DGUC可轻松纯化出纯度大于95%的完整AAV颗粒，但线性梯度液在超速离心中的运行时间通常长达16小时或更久[5]，将总工艺时间延长至2-3天，限制了CsCl-DGUC的纯化通量。

为应对这一耗时费力的挑战，我们开发了基于OptiMATE密度梯度分液系统的自动化解决方案。该设备可自动将梯度液和大量样品预先配置成线性梯度。鉴于形成线性梯度液的缓慢过程是制约DGUC运行时间的关键限制因素，预配置的线性梯度液能大幅缩短离心分离时间。而预配置梯度液的运行时间主要取决于样品颗粒迁移及运行条件所引起的梯度曲线轻微变化。此外，OptiMATE还能消除梯度液制备中的人为因素影响，提升纯化过程的一致性、准确性和易用性。

我们展示了在5个小时内自动化、高分辨率的纯化完整AAV病毒颗粒的实验流程。同时，也与16小时的传统方法进行了关键质量属性（CQAs）的对比。

方法

在本实验中，使用了AAV纯化中常用的13.5 mL和39 mL Ultra-Clear材质的快封管。

表1：自形成CsCl密度梯度 (手动) 和预形成CsCl密度梯度 (OptiMATE密度梯度液制备仪) 的离心参数

血清型AAV9通过三重转染在HEK-293细胞中表达后，裂解细胞并离心，经亲和层析初步富集所有衣壳种类，该粗纯化材料作为实验的AAV样品。使用OptiMATE氯化铯溶液制备自形成和预形成CsCl密度梯度液，以AAV样品作为稀释剂（图1）。在13.5 mL离心管加入5×1013病毒基因组（vgs）的AAV，在39 mL离心管加入1×1014 vgs的AAV。尽管预形成和自形成密度梯度的制备方法不同，但需确保每管使用等量的AAV。

我们将预形成密度梯度的超速离心时间设为5小时，因为我们预期这会产生更清晰（扩散更少）的条带。实验流程如图1所示。离心后，通过侧面穿刺提取AAV完整衣壳条带，回收材料用1×PBS+0.01% Poloxamer 188进行缓冲液替换。使用Optima AUC在230 nm处的吸光度检测回收样品中完整衣壳的纯度，以评估纯化的质量。

图1：AAV纯化方案比较：(a) 自动配置预形成CsCl梯度液和 (b) 手动配置自成型CsCl梯度。在离心运行结束时AAV样品被纯化为可见条带 (空衣壳-蓝色；完整的衣壳（红色），用注射器从管的侧面刺穿并收集条带

结果

自形成密度梯度离心管与预形成密度梯度离心管的条带存在一点差异，尤其是部分包装和完整衣壳条带的扩散度（即清晰度），以及这些条带与空衣壳条带的分离度。然而，空衣壳条带与完整衣壳条带的分离度仍足以通过肉眼观察和注射器穿刺提取回收。（结果如图2和表2所示）

图2：自形成密度梯度超速离心20小时后与预形成密度梯度超速离心5小时后代表性AAV条带图像，13.5mL离心管（左）和39mL离心管（右）

通过AUC检查回收样品的纯度（图3）。使用AUC分析得到的c (s) 图通过积分来确定纯化中完整衣壳的百分比。

图3：预形成密度梯度（红色）和自形成密度梯度（黑色）完整衣壳馏分组分的AUC数据的C (S) 图显示：在13.5 mL离心管（左）和39 mL离心管（右）中均无明显的空衣壳锋

我们观察到相近的完整衣壳纯化效率（预形成和自形成密度梯度均>90%完整衣壳），预形成密度梯度可在显著更短的5小时超速离心时间内实现等效的完整衣壳纯度，保守节省75%的时间。后续若通过进一步优化预形成密度梯度，可改善空衣壳、部分包装衣壳和完整衣壳的视觉分离度。

表2：离心后回收AAV纯度分析。13.5 mL离心管的误差值（n=3），39 mL离心管（n=1）

结论

离心时间是OptiMATE通过自动配置线性梯度液解决的关键痛点之一。因为梯度液不再依赖重力形成，预形成梯度液可显著缩短离心时间，实现更快且高效的材料纯化。在本研究中，我们证明了使用OptiMAT可将2-3天的纯化操作流程时间缩短至单日以内，在更短时间内实现等效的AAV纯度回收，便于纯化工艺的放大。此外，制备时间的减少最大限度地减少了人员的手动操作时间，显著降低了操作误差并提高了整体效率。

OptiMATE可实现真正的

自动密度梯度液分配：

• 连续密度梯度液分液（氯化铯）；

• 阶梯梯度液的快速精确铺设（碘克沙醇和蔗糖）；

• 30分钟内完成所有分液及封管步骤（6管）；

• 分液过程完全由软件程序自动控制，并可保存程序，简化方法选择；

• 自动热封管封口，消除手动封管；

• 触摸屏设计，友好的用户交互界面；

• 所有管路支持无菌消毒，体积小巧可放置在生物安全柜内，实现无菌分液。

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