细胞计数看似简单，但有时检测结果会受到来自样品的状态和仪器的测试条件等影响。在此我们使用Vi-CELL BLU 全自动细胞计数和活率分析仪，结合96 孔板上样模式，通过在单次实验中使用不同的检测条件，以此来评估对细胞计数和活率分析的影响。

待分析细胞

CHO 细胞（中国仓鼠卵巢细胞），EL4 细胞（小鼠T 淋巴细胞系），SF9 昆虫细胞（来自甜菜夜蛾的卵巢组织）和HELA 细胞（人宫颈癌细胞）。

分析目的

评估较长的分析时间和不同的样品制备条件对这些细胞计数和活率分析结果的影响。

分析结果

1CHO细胞样品制备的影响

细胞接种或做其他实验之前的细胞换洗和浓缩过程中，离心和重悬是常用的方法。

一般认为CHO 细胞是比较好生长的，但有时它们也有特别的生长要求，需要专门的培养基才能达到很好地生长。以下实验中，细胞通过1000g 离心5分钟（相对温和的离心）后，在培养基或缓冲液中重悬，然后评估样品制备对细胞活率的影响。

结果显示：在推荐的培养基中离心和重悬对CHO 细胞没有明显的影响。但是，在PBS 缓冲液中重悬对细胞活率影响较大，并且平均细胞直径也明显下降。同时，细胞密度也有一些小的减少，可能是重悬过程中损耗的。在PBS 缓冲液中的第2次离心和重悬对细胞活率和细胞大小也产生了负面影响。

图1、 CHO 细胞样品制备方法的影响

2EL4 细胞混合次数分析

EL4 细胞通常被认为是易碎的，即使在理想条件下生长也很缓慢，并且活率<70%。我们制备了EL4 细胞后，分装到96 孔板中。细胞类型使用哺乳动物细胞参数，只是混合次数有差异。目的是评估增加混合次数后细胞受到混悬和离心破坏的影响有多大。

结果显示：总细胞计数和密度及细胞直径都没有怎么变化，但活细胞数随混合次数增加逐渐下降，因而细胞活率也相应下降。这表明对于这类细胞，减少样品吹打混悬和台盼蓝染色混合次数可能会更适合，过多的吹打混匀需要避免。

图2、EL4 细胞混合次数的影响

3SF9 昆虫细胞延长检测时间的评估

即使在理想条件下SF9细胞生长要达到高密度也不容易，通常活率都在60%以下。

因此通过96孔板上测试使得检测时间延长，以此评估可能对细胞产生的负面影响。我们使用了标准昆虫细胞的参数在96 孔板上对SF9昆虫细胞进行了检测。

结果显示：在检测的3个小时过程中，细胞活率没有大的影响，细胞直径也没有太大变化，但如果细胞死亡或膨胀，这两个参数是会变化的。虽然活率较低，但在离开细胞培养环境后比较长时间内并没有不利影响，所以这些细胞足够强壮。

图3、 SF9细胞在较长一段时间中表现出的活率和平均直径

4HELA 细胞直径随时间的变化

为了胁迫细胞，HELA细胞生长成高度融合状态，然后收集并重悬分散。将HELA细胞分装到96 孔板中，通过哺乳动物细胞参数测试得到分析结果。96 孔板按每列测试，从而保证每行之间细胞检测间隔时间是一致的。我们注意到96孔板后面的样品得到稍微更高的密度。更多的研究发现：随着时间增加，细胞的平均直径会逐渐变大。

图4、HELA 细胞随时间增加平均直径增大的百分比

通过检测得到的细胞照片发现，细胞数量的增加看上去是膨胀或气泡，同时还伴有许多非细胞颗粒。虽然通过细胞分析参数设置，后者（非细胞颗粒）通常不会对细胞计数产生影响，但它们可能被计数为小细胞。膨胀效应导致平均细胞直径在3小时的检测时间内增加了差不多10%，可能导致低于最小直径阈值的更小的细胞，统计到细胞计数中。

图5、从反应器中取出时间> 2 小时后的细胞膨胀和气泡

结论

通过96 孔板对培养细胞的计数和活率分析可以进行一些初步的评估，包括确定所使用的细胞在样品制备方法和长期暴露于培养箱环境之外的健壮程度和耐受性。因为，即使是像CHO细胞或HELA细胞这样的工程细胞（通常被认为是非常强壮的），也会受到压力或特定样品制备条件的影响。