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概述
纳米乳液（简称纳米乳）作为一种新型的给药递送系统受到广泛的关注。其制备工艺简单，制剂质量稳定，具有一定的动力学和热力学稳定性，且所载药物经乳液包裹后一方面能有效提高药物的稳定性，另一方面也能降低给药的刺激性。纳米乳可以增加难溶性药物的溶解度，并且能实现同时对脂溶性药物和水溶性药物的增溶，尤其适用于成分复杂的中药提取物复方制剂的开发。
此外，纳米乳作为经皮给药制剂的给药载体，由于其粒径小的特点，能增强药物活性成分的经皮扩散速率，吸收明显加快。在实践中，高能乳化方法（如高压均质化）已被证明是获得具有小而非常均匀液滴的纳米乳剂的有效方法。
纳米乳的粒径大小及分布（即粒度分布）是实现其药理学活性、药物的生物利用度等以上优越性能的重要质量控制指标。本文将探讨动态光散射技术（DLS）在表征纳米乳粒度方面的应用。
DLS技术是用于样品粒度检测的技术，该技术检测进行随机布朗运动的颗粒发出的散射光强度随着时间推移发生的波动。分析这些强度波动可得到扩散系数，从而可通过Stokes-Einstein方程得到粒度。
其中，D为扩散系数，KB为玻尔兹曼常数，T为环境绝对温度，η为介质粘度，DH为颗粒的流体力学直径。
NS-90纳米粒度仪是一款经典的DLS仪器，可以快速、准确测量从纳米到亚微米级的颗粒尺寸。分析软件易于使用，提供有关数据质量的可靠实时反馈，以及如何改进结果的指导。
实验
本应用报告使用纳米粒度仪表征了3个高压均质纳米乳液样品的粒度。测量结果分别采用欧美克仪器的NS-90和马尔文帕纳科的Zetasizer nano ZS在25ºC下完成， 其中，NS-90采用传统90度角测量原理，Zetasizer nano ZS采用非侵入背散射(NIBS)技术。
结果
测样方法开发
观察样品状态，发现多个样品中均有极少量纤维状杂质，因此所有样品用1μm滤膜过滤进行预处理以去除杂质。
以3#样品为例，观察原液可见其浊度较高，透光性不佳。分别用Zetasizer nano ZS与NS-90测试该样品原液。
A 后向角度Zetasizer nano ZS
B侧向角度 NS-90
▲ 图1： 不同角度纳米仪检测3#样品原液的粒度结果
其中，Z-Average是指定强度加权平均流体动力学直径。流体动力学直径（DH）定义为与被测颗粒或分子有相同扩散速度的刚性球体直径。PdI（Polydispersity index）多分散指数，是对数据累积分析得出的颗粒尺寸分布宽度的无量纲数值。PdI 值范围为 0 到 1，值越高表示多分散性越强，数值越小表示粒度越均匀。这些参数均根据国际标准ISO13321，采用动态光散射DLS技术计算。
对比图1A、1B可见，NS-90的PdI较大，且粒度分布曲线（即PSD curve，基于光强分布）在40~50nm附近有肩峰；结合Zetasizer nano ZS测量位置在接近池壁的0.65mm等信息（这表明发生了多重散射），可知该样品原液浓度过高，侧向角度测量时发生了重复散射，结果出现了小颗粒部分的“假峰”。
用纯净水稀释样品，逐渐增加稀释倍数，在NS-90上做平行对比测试。发现随着样品稀释倍数的增加，Z-Average微幅减小；当稀释倍数达到5倍之后，Z-Average趋于稳定。这是因为，在浓度较高的原液中，颗粒之间的作用力以吸引力为主，检测到的粒径为表观粒径，结果偏大；随着样品浓度的降低，颗粒之间的吸引力和排斥力达到平衡，粒径不再依赖于浓度的变化，测得可靠的粒径。另外，随着样品稀释倍数的增加，PdI也随之降低直至稳定（图2）。
▲ 图2：3#样品稀释浓度滴定曲线
观察光强分布曲线，可以看到小颗粒假峰消失，PdI降低到0.164（图3）。
▲ 图3：3#样品稀释5倍后在NS-90上的检测结果
这与采用背散射技术的Zetasizer nano ZS的检测结果相符。
不同散射角度光强分布结果的差异
将NS-90与Zetasizer nano ZS的结果做比对（见表1），可以发现不同样品之间Z-Average的大小顺序在两台仪器上均一致；但对于同一样品， Zetasizer nano ZS较NS-90， Z-Average普遍偏小4~7%不等。
▲ 表1：NS-90与Zetasizer nano ZS的结果比对
到底哪个结果更准确呢？
根据瑞利散射理论（Rayleigh Scattering Theory）和米氏散射理论（Mie Scattering Theory），当颗粒小于激光波长λ的1/10时，其散射光强在所有散射方向上等同，即各向同性散射；当颗粒尺寸大于λ/10时，前向散射发生散射扭曲，信号更往前倾。因此，大颗粒是各向异性散射的，即在不同角度的散射信号有区别。这通常意味着对于相同的大颗粒样品，选择不同的检测角度，可以得到不同的粒度结果。
本文使用的纳米粒度仪光源都采用红光He-Ne激光器，波长λ为633nm。根据上述原理，当颗粒直径大于λ/10即60nm左右时，DLS法的检测结果会依赖于信号收集角度。
▲ 图3：不同粒径球形颗粒的散射光强的矢极图
图3展示了不同粒径的球形颗粒在633nm入射光的照射下，散射光在二维空间上的强度分布对比情况。50nm颗粒的散射光强在各个方向上都是一致的，从100nm颗粒开始散射光强就有前倾发生；随着粒径的逐渐增大，散射光前倾情况愈加显著。
▲ 图4：不同角度散射光强与颗粒直径的函数图
当颗粒物的折射率为1.45，吸收率为0.001时，单个颗粒和单位体积的散射光强与颗粒直径的函数关系如图4。其中，红色代表侧向散射，蓝色代表后向散射。可见，当颗粒大于60nm后，侧向散射的散射光强度随着尺寸的增加呈指数增长，而对于后向散射这种影响并不明显。这表明在大颗粒区间对于适当分布宽度的同一样品，侧向散射的结果中大颗粒的权重会更大；而后向散射结果相较而言将略微偏小。（如表1）
▲ 图5：AAV病毒在不同检测角度纳米仪中的表现
在极端情况下，对于宽分布样品，后向散射结果会更小。图5的AAV病毒样品因为团聚体的在173°的光强贡献远远低于90°，在后向散射中，第二个亚微米级团聚体的峰的占比更低，Z-Average也更小。
现在可以回答前面的问题了，到底侧向散射和后向散射的结果哪个更准确呢？答案是两个结果都对，都具有参考性！因为纳米粒度仪直接测得的是基于光强加权的粒度结果，而散射光强度依赖于散射角度。
因此，不同的仪器之间在做数据传递时，请务必同时报告仪器所采用的检测角度。
数量分布测量结果评价
首先让我们来考察不同的统计方式对粒度结果的影响。假设有2个球形的颗粒，直径相差10倍，分别是5nm和50nm，采用不同的统计方法计算得到的平均粒径如下：
▲ 图6：不同统计方式的颗粒粒度分布
从以上例子和图6可见，数量统计对小颗粒的存在更敏感，光强统计对大颗粒更敏感。
还是以3#纳米乳为例，分别在侧向和后向检测原液，应用米氏理论，输入颗粒物的折射率和吸收率，从光强分布结果转换得到数量分布结果（图7A、7B）。可见在光强分布中差异并不大的两个结果，数量分布差异则会很大。侧向散射的光强分布中因为重复散射在40~50nm附近的小颗粒假峰，在数量分布中成为了整体粒度分布的主体；因此，在数量分布中侧向散射结果较后向偏细很多。
A 光强粒度分布
B 数量粒度分布
▲ 图7：3#纳米乳原液不同角度检测结果对比
分别在侧向和后向检测稀释5倍后的3#纳米乳，样品浓度降低后没有重复散射现象了，侧向散射的小颗粒假峰也消失了。无论是光强分布还是数量分布，不同角度的检测结果都是高度一致的（图8A、8B）。
A 光强粒度分布
B 数量粒度分布
▲ 图8：3#纳米乳稀释5倍后不同角度检测结果对比
结论和讨论
本文应用DLS技术表征不同配方的纳米乳液的粒径，当样品浓度较高时，发生了重复散射，光强粒度分布出现了样品里本不存在的小颗粒的肩峰，导致数量粒度分布异常偏小；将样品做适当的稀释处理后，得到更真实且稳定的光强和数量粒度分布结果。
纳米乳作为药物递送系统，其优势在于能有效提高生物利用度、增强靶向作用的同时，巧妙地调控药物的缓释效果。然而，这些优势的充分展现依赖于对其粒度分布的工艺调节和把控。
颗粒尺寸过大的纳米乳除了容易导致药物在非目标部位积累，降低药物的靶向性，甚至增加不必要的毒副作用外，还会阻碍药物的有效释放，降低其生物利用度。这种影响不仅削弱了纳米药物的治疗效果，还可能产生反作用，并对治疗造成负面影响。在纳米乳的较多应用中，更偏好粒径小且粒度分布窄的产品，这样的纳米乳通常具有更好的药效并表现出良好的制剂稳定性。因此，采用对大颗粒更敏感的侧向角度检测技术来分析纳米药物的粒度分布时，可以更灵敏地捕捉到样品中的大颗粒信息，获得更准确的粒度分布结果，以便于有效地指导工艺参数的调整和配方的改进。
综上所述，动态光散射是对纳米乳液粒度进行表征的理想技术；无论采用侧向散射还是后向散射技术，都需要找到合适的样品浓度，开发科学、可靠的检测方法，并根据具体应用中的重点关注指标和质控对象，在侧向角度检测和后向角度检测中作出合适的平衡和选择。
参考文献
1.Zhang R, Cheng L, Luo L, et al. Formation and Characterisation of high-internal-phase emulsions stabilised by high-pressure homogenised quinoa protein isolate.
2.Sadurni N, Solans C, Azemar N, et al. Studies on the formation of O/W nano-emulsions, by low-energy emulsification methods, suitable for pharmaceutical applications.
3.高压微射流纳米均质法制备一种难溶药物纳米乳应用举例. ;
