评估生物大分子的稳定性至关重要，因为这直接关系到其在药物开发、疾病诊断、治疗以及基础生物学研究中的应用前景和实际效能。稳定性的评估能够确保生物大分子在制备、存储、运输及应用过程中保持其结构和功能，从而发挥预期的生物学活性，提高生物产品的疗效和安全性。此外，稳定性数据对于优化生物大分子的生产和纯化过程、延长其货架寿命、减少成本以及推动科学研究的深入都有着不可或缺的作用。

在生物技术药物开发的“质量源于设计”(QbD) 方法中，稳定性表征是所有候选药物的“开发可行性”和“成药性”评估以及流程开发和生产的一部分。稳定性数据还整合到用于生产支持、生物技术药物可比性和生物相似性评估的高级结构 (HOS) 表征和“指纹图谱”中。

由于生物大分子结构十分复杂，生物物理工具在生物制药产品的完全表征中非常重要。评估生物大分子稳定性的生物物理工具多种多样，其中差示扫描量热法（DSC）与差示扫描荧光法（DSF）是表征生物大分子高级结构稳定性的常用技术，本文主要聚焦两种技术的异同点，旨在帮助大家选择合适的技术评估各类生物大分子的稳定性。

DSC 与 DSF，一字之差，大有不同

DSC：溶液中生物大分子以恒定加热速率由自然（折叠）到变性（展开），此过程涉及非共价键的断裂为吸热过程，DSC可以实时监测生物分子随温度变化而发生的热容（C_p）改变，通过对数据的处理（如积分）可以获取如T_m值、T_onset、ΔH、ΔC_p等热力学信息。

DSF：溶液中生物大分子以恒定加热速率/不同变性剂条件下由自然（折叠）到变性（展开），DSF可以实时监测由于色氨酸从疏水到亲水环境所导致的发射波长改变/由于疏水区域暴露和环境敏感的疏水染料结合导致的荧光变化，进而获取T_m、T_onset等参数。

DSC：由于DSC是监测维系生物分子高级结构非共价键断裂的热量吸收，所以对于蛋白、核酸、脂质等各类分子都适用。

DSF：由于DSF是监测色氨酸或疏水区暴露所引起的发射波长或荧光信号的变化，所以测试样品需有丰富的色氨酸/疏水区，DSF仅适用某些蛋白样品，不适用于核酸、脂质等样品。若测试前蛋白已有部分变性（疏水区暴露）或样品中含有去垢剂，则会造成较强的背景荧光。

DSC：通过DSC测试所得到的T_m（热转变中点温度）为体系中50%生物分子变性对应的温度，即峰值所对应的温度；ΔH_cal为每摩尔蛋白变性所吸收的热量，一般用于衡量体系中生物分子的活性含量。

DSF：通过DSF测试得到的T_m值为体系中50%色氨酸/疏水区暴露时所对应的温度，色氨酸/疏水区的暴露无法真实的反应蛋白变性过程，同时无法获得ΔH等样品活性信息。

DSC：由于DSC具有良好的重复性，适合批间一致性分析和生物相似性打分分析；同时DSC具有结构域级分辨率（可区分抗体CH2、CH3、Fab区域），适用于抗体等多个结构域样品的稳定性评估。

DSF：DSF的重复性较差，难以进行定量分析，但分析速度较快，适合稳定性的快速初步筛选。

DSC在核酸分析中的应用

与传统的小分子药物和抗体药物相比，核酸药物可针对不可成药靶点、无需复杂蛋白生产工艺、具有设计简便、研发周期短、靶向特异性强、治疗领域广泛和长效性等优点，目前在遗传疾病、肿瘤、病毒感染等疾病的治疗上应用广泛，有望成为继小分子药物和抗体药物后的第三大类药物。然而，由于核酸药物本身携带负电、容易降解等问题，导致其稳定性差、半衰期短、递送效率低，因此需要经过化学修饰或者是递送系统达到长期有效的治疗效果。DSC可以非常灵敏的反应出核酸化学修饰前后稳定性的差异，然而其他稳定性分析技术可能无法反应出这些微小的变化。

DSC用于分析锁核酸（LNA）掺入核酸的影响

锁核酸（LNA）是一种经过修饰的RNA，LNA中一部分核糖上的2‘与4’碳连结在一起，降低了核糖结构的柔韧性，进而增强磷酸盐骨架的局部结构的稳定性。该应用利用DSC技术研究了LNA的掺入对DNA、RNA异源双链体杂交热力学的影响。LNA修饰后，峰图明显向右偏移；同时，随着LNA修饰个数的增加，Tm值逐渐升高，表示杂交体的稳定性因LNA的掺入变得更加稳定。

DSC用于表征mRNA-LNP

通过PEAQ-DSC提供的LNP热力学指纹图谱，可以对比游离mRNA、mRNA-LNP以及LNP的稳定性变化（图2）。从图中来看，mRNA组装于LNP之后，T_m增大，表明mRNA-lipid产生相互作用之后，能稳定彼此结构，使得mRNA-LNP组装更稳定。

与DSF技术相比，DSC技术具有多方面优势，因此被公认为是生物制药行业中热稳定性试验的金标准技术：

• 无需标记，适用样品类型更丰富，且不受荧光背景及buffer成分干扰；

• 更宽的温度范围，适用具有较高T_m的样品；

• 提供除T_m之外丰富的热力学信息；

• 全局测定技术，具备高分辨率、高重复性，可分辨多结构域样品；

如果您分析的样品为不含色氨酸的蛋白样品或其它非蛋白样品，或是要进行精细的蛋白设计与改造、候选物筛选、配方优化、可比性相似性评估等多种应用，DSC都将是您的最优选择！