本文摘要

扩散屏障法是一种通过最小化测量过程的影响来可靠地测量蛋白质电泳迁移率的方法。蛋白质与施加电场所用的电极接触会导致样品发生变性和聚集，导致Zeta电位明显变化。本文记录Zetasizer纳米粒度电位仪利用扩散屏障法将样品分子与电极分离，可以很好地避免电极接触对蛋白质测量的影响。

扩散屏障法简介

开发基于蛋白质的产品需要了解它们在溶液中的表现，而测量样品的Zeta电位可通过预测聚集行为，研究蛋白质制剂的稳定性。但在实际测量过程中，Zeta电位明显变化并不是电场本身导致了蛋白质的聚集，其变化的真正原因是蛋白质与电极的接触导致。

本文将介绍一种新的方法：扩散屏障法，可以提高测量样品Zeta电位时的准确性和可重复性。

扩散屏障法通过引入一个较小的样品量，用溶解蛋白质的相同缓冲液将样品与电极分离，因此电极对蛋白质的影响大大降低。由于这种保护仅由样品与电极的距离提供，在样品扩散到电极之前，样品都不会受其影响。而这一过程可能需要数小时，因为只测量了可溶性天然蛋白的迁移率，使得样品的测量结果更加可靠。

测量过程

一、样品装载

首先将溶解蛋白质的缓冲液注入折叠毛细管样品池中。然后将样品池放入Zetasizer纳米粒度电位仪中静置2至3分钟，使其温度达到平衡。这将减少任何与温度有关的流体运动，如对流。然后取出样品池，通过图1所示的枪头将20~100 μL的样品直接注入毛细管样品池的最底部（图2）。

图 1 200μl的凝胶上样移液枪头

图2 折叠毛细管孔中的凝胶移液枪头，用于装载扩散屏障方法的样品量

图3 装样对比图：在10 mM NaCl中完全充满蓝色葡聚糖的样品池（左）；样品池填充10 mM NaCl，并加入50 μl蓝色葡聚糖作为扩散屏障（右）

很明显，样品的蓝色部分位于样品池的测量体积中，距离样品池顶部的电极有相当大的距离。如果样品池保持直立并小心处理，样品将不会在样品池内部扩散。在开始测量之前，应使温度达到平衡。

二、迁移率测量

理论上，使用扩散屏障法进行迁移率测量与在Zetasizer Nano中进行常规测量完全相同。在实际测样过程中，离子强度较高的缓冲液会有较高的电导率，导致在给定电压下焦耳加热增加。需要进行一些手动改进，以提高使用扩散屏障法进行测量的数据质量。

为了避免显著的焦耳热，应根据所使用的缓冲液的导电性来选择电压。如表1所示，在软件中自动选择适当的电压，随着缓冲盐的浓度增加，所用的电压降低，并且运行次数最多为20次，以尽量减少焦耳热。建议在两次测量之间设置180秒的延迟，这也是为了确保测量之间的温度平衡。

表1：给定浓度缓冲液的建议电压和最大运行次数

Zetasizer软件版本7及以上的蛋白质迁移率测量类型将使所有这些设置自动化，使测量尽可能简单。

评估数据质量

一，粒径分布变化

建议在zeta电位测量之前和之后都进行粒径测量，以检查样品是否因电位测量而发生变化。如果迁移率测量影响了样品并导致其聚集，这些聚集应该出现在迁移率测量后的尺寸测量数据中。图4A显示了在任何迁移率测量之前的粒径测量示例。该样本不含聚集体，PDI为0.05。在常规的zeta电位测量后，聚集体已经形成，PDI接近0.2（图4B）。然而，当采用扩散屏障法时，没有形成聚集体，迁移率测量后的PDI仍然低于0.05（图4C）。

图4A 样品迁移率测量前的粒径分布

图4B 样品常规迁移率测量后的粒径分布

图4C 使用扩散屏障法测量迁移率后的粒径分布

二、频率分布的对比

样品中的聚集体将具有较低的布朗运动速度，从而在频率图中产生一个尖锐的峰值。因此，频率图中出现宽峰是识别高质量数据的好方法。

图5显示了蛋白质迁移率测量的两个频率图。图5A显示了使用扩散屏障法重复测量的频率宽峰，连续测量的图重叠良好，表明没有聚集物存在。图5B显示了未使用扩散屏障法的连续测量叠加图。第一个测量是红线，它显示了广泛的分布和良好的测量。然而，随着测量的进行，由绿蓝线和黑线表示，很明显，一个大而尖锐的峰正在形成，这代表了在测量过程中聚集的样品。多次测量的图不一致，因此无法获得可重复的迁移率测量。

图5A 使用扩散屏障法进行的连续测量的频率图

图5B：常规迁移率测量的频率图

焦耳热是测量重复性下降的原因之一，而通过电导率的测量可以有效识别焦耳热。为了尽量减少焦耳热的影响，电导率应限制在连续测量之间的增加不超过5-10%。如果它的增加超过这个值，则表明已经发生了明显的加热，这可能会影响样品并降低测量的可重复性。

至少要进行5次测量，以确保数据是可重复的。在方法开发过程中，建议测试一种廉价的替代蛋白质，以优化方法。

结论

通过应用扩散屏障法，可以有效消除在使用电泳光散射法进行Zeta电位测量时蛋白质样品和电极的相互作用造成的聚集。通过最小化样品体积并将蛋白质与电极分离，这种新方法是一种简单、强大的解决方案，可以在不损害蛋白质本身的情况下对蛋白质的迁移率进行高度可重复的测量。

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